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      常見問題
      常見問題

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      • ProSpec 細胞因子和重組蛋白溶解

        我們知道,ProSpec 相當一部分細胞因子和蛋白為凍干粉,這使得運輸非常便捷,只要常溫即可。而且,細胞因子和蛋白 凍干粉非常穩定,在-20-80條件下可保存數年。凍干粉在使用前需進行溶解,然后以液體形式加到培養體系。溶解步驟非 常關鍵,因溶解不好會導致細胞因子或蛋白的失活,這也是很多用戶在實際使用中經常遇到的問題。

        那么,應該如何進行正確的溶解呢? 

        下面我們以 Recombinant Human IL-4 (重組人 IL-4,產品編號:CYT-211)的說明書為例,對細胞因子或蛋白的溶解方法 進行詳細的闡述。 

        拿到重組人 IL-4 的說明書后,您會發現有一段關于 Reconstitution(重懸)的敘述,這段內容含有溶解相關的所有信息。


        1. Centrifuge the vial prior to opening  

        1 步:開蓋前離心試劑管 

        ProSpec 的細胞因子或蛋白凍干粉裝盛在塑料管中,為無菌包裝。凍干粉在運輸過程中可能會因顛簸而漂散并粘貼于管壁 或管蓋上,所以在打開塑料瓶蓋前,需將凍干粉通過離心收集到管底,以便用很小體積的液體即可將凍干粉完全溶解。 

        有很多用戶會問一個問題,即應該用多少轉速、多長時間離心試劑管,才能達到良好的收集效果? 

        答:有些小型高速離心機(多為進口品牌)的面板上有一個 Spin 鍵,按了此鍵后,離心機會自動快速上升到其最大速度 (10000rpm 12000rpm),上升到最高點后速度即刻下降,直至停止旋轉,整個過程大約 30s。這個 Spin 鍵足以很好的將細 胞因子或蛋白收集到管底。但有些實驗室沒有這樣的高速離心機,只有最高轉速為 4000-4500rpm 的離心機。這種情況下,需 3000-3500rpm 離心 5min,也能達到類似的效果。


        2. Reconstitute in water to a concentration of 0.1-1.0 mg/ml. Do notvortex. 

        2 步:用無菌水重懸至 0.1-1.0 mg/ml,不可振蕩。 

        這個步驟即為溶解步驟,非常重要。 

        1) 一定要用推薦的溶液重懸(或溶解)凍干粉 

        用于溶解細胞因子或蛋白的溶液千差萬別。此例中的重組人 IL-4 需用水溶解,而重組人 IL-2 (產品編號:CYT-209)則需用 20mM Acetic Acid (醋酸)溶解,重組人 TGF-beta1(產品編號:CYT-716)需用 10mMAcetic Acid (醋酸)溶解 (注:即使同一 重組細胞因子或蛋白,不同批次的溶解方法也可能有所不同,因此上面的敘述僅供參考。具體應該如何溶解應以相應批次的官方 說明書為準)。后續的文章中將對各種溶解液的配制方法進行詳細的闡述,望繼續關注。 

        經常有用戶會問,為什么會有這么多種溶解方法? 

        答:我們知道,蛋白的溶解性與很多因素有關,其中比較重要的是 pH 值和離子強度。ProSpec 的細胞因子或重組蛋白在 出廠前均經嚴格測試,說明上所標明的溶解液是能夠將該細胞因子或重組蛋白完全溶解的液體。如果您所用的溶解液的 pH 值和 離子強度與說明書中所標明的不符,很多時候會造成細胞因子或重組蛋白不能完全溶解或者根本無法溶解,這樣所配得的細胞因 子或重組蛋白必然活性不夠或喪失。 

        有不少用戶沒注意說明書上的描述,而是根據習慣,直接用 PBS 或培養液(1640 或 DMEM 等)等溶解細胞因子或蛋白的 凍干粉。這樣做可以嗎?

        答:有時可以,要看具體情況。ProSpec 的大多數細胞因子或蛋白凍干粉的溶解液不是 PBS,此時千萬不能用 PBS 或培 養液直接來溶解,具體原因在上面已經敘述過。而有部分細胞因子,如重組人 KGF 和重組人 FGF-23 等,說明書上的溶解液即為 1x PBS,此時用 PBS 溶解完全沒問題,那么用培養液溶解也是可以的,不過最好還是用先用 PBS 溶解,然后再用培養液稀釋。 

        2) 一定要溶解到指定的濃度。 蛋白在一定的濃度范圍內可以保持良好的穩定性,這個范圍就是說明書上所標明的濃度范圍,該例為 0.1-1.0mg/ml。 這個濃度范圍對于不同的細胞因子或重組蛋白是不同的。 

        高于或低于該濃度范圍會有什么問題呢? 

        答:首先,細胞因子或蛋白會不穩定,即很容易出現活性下降的現象。其次,高于這個濃度范圍,可能會超過該蛋白的 最大溶解濃度,即蛋白無法完全溶解。再者,高于或低于該濃度范圍,蛋白可能會出現聚集(aggregation),最終結果還是部分 蛋白未溶解,導致蛋白活性的減弱。 

        3) 一定不能振蕩(vortex)。 

        這里所說的振蕩是指用渦旋儀進行快速振蕩。 

        有用戶會問,若想保證溶解液與凍干粉充分混勻,以實現細胞因子或重組蛋白的完全溶解,該怎么辦呢?

        答:多數細胞因子或重組蛋白的凍干粉是非常容易溶解的,一般我們用移液槍的槍頭輕吹幾下,即可使細胞因子或重組 蛋白完全溶解。 

        對于不易溶解的細胞因子或蛋白,ProSpec 會在說明書中進行備注。這種情況下,您最好能將要溶解的細胞因子或重組 蛋白放在水平搖床(shaker)上低速搖一段時間,促使細胞因子或重組蛋白完全溶解。 


        3. This solution can be stored at 2-8for up to 1week. 

        3 步:該重懸液在 2-8最長可保存 1 周。 

        用說明書上推薦的溶液將細胞因子或重組蛋白重懸到推薦的濃度后,細胞因子或重組蛋白可放置在 2-8,即冰箱的冷藏室。 在這種條件下,細胞因子或重組蛋白的活性最長可保持 1 周。這對一個周期為 5-7 天的實驗,如 DC(樹突狀細胞)的誘導成熟是 足夠的。在此期間,只要每次從冰箱里吸取一定量的細胞因子或重組蛋白溶液加入到培養體系內即可。 

        其實,說明書上推薦的濃度對于一般的實驗來講是比較高的。所以用戶通常會將該溶液進一步稀釋后再放在 4保存,待 1 周內用完。如進行稀釋,必須遵照下面第 4 步的方法,即需用含載體蛋白的溶液進行稀釋,否則稀釋后的細胞因子或重組蛋白很 容易會粘附在管壁或瓶壁上,使得溶液中的細胞因子或重組蛋白的濃度下降,細胞因子或重組蛋白的總活性則大為減弱。


        4. For extended storage, it is recommended to further dilute in abuffer containing a carrier protein (example 0.1%  BSA) and store in workingaliquots at -20to -80

        4 步:如要長期保存,則需用含載體蛋白(0.1% BSA,或 10% FBS,或 5% HSA)的溶液進一步稀釋,然后分裝凍存于-20-80。 

        如果一個實驗周期長于一周,或配制的細胞因子或重組蛋白一次用不完,我們就需對細胞因子或重組蛋白進行長期保存。 方法是:將已重懸的細胞因子或蛋白用含載體蛋白,如 0.1%BSA(牛血清白蛋白),10% FBS(胎牛血清),5% HSA(人血清白蛋白) 的溶液將重懸液進一步稀釋,然后分裝凍存于-20-80,即常規冰箱的冷凍室或超低溫冰箱中。 

        經常有人會在細胞因子或重組蛋白凍干粉用推薦的溶液重懸后直接分裝凍存于-20至-80,這樣可以嗎? 

        答:不行。我們知道,塑料管壁對多數蛋白均有很好的吸附作用,也就是說溶液中的蛋白很容易粘附在管壁。粘附后, 蛋白是很難與管壁分離的。做過 ELISA 實驗的人都知道,ELISA 的包被抗體(Capture antibody)就是通過這種粘附作用包被到酶 標板上的。 

        載體蛋白,如 1% BSA,10% FBS(胎牛血清)5% HSA 等的主要作用是預先封閉塑料管壁上的蛋白結合位點,使細胞因子 或重組蛋白不會粘附于管壁。如果在細胞因子或重組蛋白凍干粉用推薦的溶液重懸后不用含載體蛋白的溶液進一步稀釋,而直接 分裝凍存,則溶液中的大部分細胞因子或重組蛋白均會粘附到管壁上,導致溶液中實際溶解的細胞因子或重組蛋白的濃度大為降 低,最終表現為細胞因子或重組蛋白活性的下降。 

        因此,在分裝凍存前,一定要用含載體蛋白的溶液將重懸液進一步稀釋。稀釋后的細胞因子或重組蛋白可為任意濃度,因大 量的載體蛋白可以保證低濃度細胞因子或重組蛋白仍然維持較高的穩定性。 

        那么,含載體蛋白的溶液指的是什么溶液呢?水可以嗎? 

        答:水不可。該溶液通常是指 pH 近中性,有一定緩沖能力的緩沖液,如 PBS,培養液(RPMI1640, DMEM )等。 

        還有一個經常被問及的問題,即在做無血清培養或動物的體內實驗時,細胞因子中不能含有 BSA,FBS 或 HSA 等動物或 人的蛋白,要想長期保存細胞因子或重組蛋白該怎么辦呢? 

        答:一種方法是訂購 ProSpec 的小包裝細胞因子或重組蛋白,每次使用一只,用后即廢棄。


        5. 后續稀釋液的配方:即原產品的溶液的配方。 

        總之,為保證細胞因子或重組蛋白凍干份在重懸后仍能保持良好的生物活性,必須按照說明書中 Reconstitution 的方法 嚴格操作。 

        蛋白有價,實驗無價,愿大家珍惜每次實驗機會,嚴謹認真,每次均能得到預期的實驗結果!


      • 如何確定細胞因子的種屬交叉活性?

        1) 除少數例外,大多數人類細胞因子對小鼠細胞均有活性。

        2) 許多小鼠細胞因子也可作用于人類細胞,但比活性可能低 于對應的人類細胞因子。 

        3) IL-7 等為數不多的人類細胞因子作用于小鼠細胞時比對應的小鼠細胞因子活性更強。

        4) 干擾素, GM-CSF, IL-3 IL-4 等細胞因子種屬特異,對非同源細胞幾乎沒有活性。

        5) 相反,成纖維細胞生長因子(FGFs)和神經營養素 (neurotrophins)高度保守,在不同動物種屬細胞上均具有很好的活性。

      • ED50 和 units/mg 之間有何關聯?

        ED50 為半數有效濃度,其定義是可誘導 50%最大反應的細胞因子濃度,這種活性表示法僅適用于劑量反應曲線呈 S 的細胞因子。其實,可以將 ED50 的值接理解為 1unit。如某種細胞因子或蛋白的 ED50 1ng/ml,那么 1ng/ml 即可看作是 1unit。 那么我們也不難理解,1mg(1x106ng) 該細胞因子或蛋白中應含 1x106/1= 106units. ED50(ng/ml)轉化為 units/mg 的公式如下:

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      • 為什么有時在管中看不到細胞因子或蛋白的凍干粉?

        與市場上的許多蛋白產品不同,ProSpec 的產品中均不含載體蛋白或其它添加物(如牛血清白蛋白(BSA),人血清白蛋白 (HSA)和蔗糖等,并且是以最低含鹽量的溶液進行凍干的,因此凍干后常常不能形成白色網架結構,而是微量的蛋白在凍干過程 中沉積在管內,形成很薄或肉眼不可見的透明蛋白層。打開管蓋前,我們建議您在小離心機中快速離心 20-30 秒,使附著在管蓋 或管壁上的蛋白聚集于管底。我們的質控步驟保證每管中所含的蛋白量準確無誤,雖然有時您無法看到蛋白粉末,但管中的蛋白 含量仍是非常精確的。

      • ProSpec 細胞因子和蛋白產品的穩定性如何?

        除非在產品說明書中特別注明,ProSpec 相當一部分產品為凍干粉,它們在室溫條件下非常穩定(至少 1 個月)。盡管如 此,我們還是建議您在收到我們的產品后保存于-20℃,以確保蛋白 100%的活性。對于大多數蛋白,重懸后在 4℃僅能短期保存 (1 )。如想長期保存,請先配制成稀釋液(其中必須含有載體蛋白,如 0.1% BSA,5%HSA,或 10% FBS),然后分裝凍存于 -20℃-80℃。一定要避免反復凍融,因每次凍融均會引起蛋白的部分失活。

      • Abnova抗體應用類型:

        WB           Western Blot

        WB-Ce   Western Blot (Cell lysate)         細胞裂解液(天然細胞,內源)

        WB-Re   Western Blot (Recombinant protein)   重組蛋白(外源轉染質粒到細菌,表達蛋白)

        WB-Ti   Western Blot (Tissue lysate)      組織裂解液(天然組織,內源)

        WB-Tr   Western Blot (Transfected lysate)      轉染裂解液(外源轉染質粒到細胞,表達蛋白)

        image.png

        實驗類型選擇優先(涵蓋范圍):


        WB > WB-Ti > WB-Ce  


        WB-Re 和 WB-Tr,不推薦。如果客戶購買,建議跟客戶講一下,非官網承諾應用類型,廠家不受理投訴。


      • Abnova抗體可以做多少張玻片(IF/IHC)?

        【以1:500稀釋比,30ul的小包裝抗體為例】


        1:500稀釋 = 500ul 抗體稀釋液中加入1ul原始抗體 ==》30ul原始抗體可以配置成為30ul * 500 = 15ml的稀釋后的抗體【工作液】,一張玻片一般用50ul的抗體工作液 = 15 ml / 50ul = 300張

        如果是1:200稀釋的話,= 120張


        作業:WB實驗,一條膜通常需要1ml的工作液(1:1000稀釋的話,需要加入1ul原始抗體溶液),實驗次數自算?


        PS: 1 ml = 1000 ul


      • ICC,IF,IHC區別

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      • 試劑盒-標準曲線不一樣?

        · ELISA比色法實驗顯色,是一個酶催化的實驗。在一定范圍內,環境溫度越高,酶活性越強,相同孵育時間內,溫度高的,檢測數據高。相同溫度,孵育時間長的,檢測數據高。

        · 說明書的標曲只是一個參考用途,展示大概的結果形式。不能直接使用,否則,試劑盒就沒有必要提供標準品了,客戶直接用說明書的曲線來計算了,對吧?!久看螌嶒?,當時都需要做標準曲線,才是最準確的方法】

        · 標準曲線是否良好? 客戶可以繪制相應的擬合曲線(線性,或者曲線形式),R2大于0.9以上是可以接受的,0.99那就是非常好,小數點后面9越多越好。


      • 試劑盒做多少個樣品? [舉例:KET6013]

        * 試劑盒規格的48或者96,通常代表的是反應次數或者孔的數量。而不是樣品數量。(標準品,對照都會參與到反應或者加入到孔中,因此樣品數量肯定會少)


        試劑盒做一次實驗,需要客戶做:6個標準品(標準品數量,根據各個說明書里面說的來設置,6個濃度點)+ 一個空白孔(標準含量為0) = 7。通常每個實驗都要做復孔(最少2個復孔,也有做3個復孔的。2個復孔意味著1個東西,需要加到2個孔,統計學需求,算平均值等),這么一來被占用的孔就是7*2=14個孔。96-14=82個孔,只有這82個孔可以給客戶拿去測試他的樣品。如果也算是復孔,那么就是82/2=41個樣品。這是最多可以測試多少樣品。

        image.png

        總結:

        【2個復孔】樣品數量= [ 96 - (標準品數量+對照組數量)*2] / 2

        【3個復孔】樣品數量= [ 96 - (標準品數量+對照組數量)*3] / 3


        #強調#:標準品的數量,陽性對照,陰性對照 的設置,根據說明書來,有些試劑盒是沒有陽性對照的。


        以上為一次性將試劑盒用完的樣品數量。如果客戶要做2次實驗,需要繪制2次標曲。對應的,繼續相減。



      • 特殊檢測類型:生物發光法,bio-luminescence

        1. 主要涉及ATP類的試劑盒,消耗能量ATP,發光(螢火蟲)。

        2. 主要的實驗:熒光素酶分析實驗。

        image.png

        使用儀器:

        1. 化學發光儀,

        2. 光度計(Luminometer),

        3. 多功能酶標儀(含化學發光,生物發光檢測模塊)。


      • ELISA實驗數據不穩定,背景高:洗滌很關鍵

        1.試劑盒使用前,通常需要在室溫下平衡30-60min。(溫度對酶催化反應有影響)。

        2.洗板時需保證微孔板平放,將洗滌液注滿各孔,但盡量避免漏液溢液,以每孔300 μl為宜;板洗次數一般為3次,要保證洗板的浸泡時間,每次浸泡時間一般為30-60 秒;盡量減少洗液殘留量,推薦每次洗板后進行拍板,并及時更換吸水紙,避免吸水紙的碎屑粘到反應孔內。


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